石蜡包埋(石蜡切片免疫组织化学)
1.组织的收集、固定和保存:
组织之后，
方法:4%多聚甲醛(4% PFA)在4℃固定1小时(固定时间根据组织大小和密度调整)或过夜。
方法2:使用bou in’s固定rt 2h (6-8d tessis)或rt过夜(成人tessis)
PBS缓冲液洗涤三次，每次5分钟，并储存在4℃的70%乙醇中
2.组织的包埋、切片、铺展和保存:
固定的样品用梯度乙醇脱水，用二甲苯透明，在52-54℃下包埋在石蜡中，常规切片，厚度为4 -10mm，粘贴在处理过的干净载玻片上，在37℃下烘烤过夜，然后收集在载玻片盒中，密封并通过RT保存
石蜡包埋:
组织样本储存在4°C的70%乙醇中
80%乙醇15分钟
95%乙醇15分钟
100%乙醇15分钟
1/2乙醇和1/2二甲苯15分钟
透明二甲苯5-10分钟
1/2二甲苯1/2石蜡30分钟
石蜡(1)1.5小时
石蜡(2)1.5-2.5小时
石蜡(3)包埋
RT保存
3.石蜡切片的免疫组织化学方法:
组织切片在室温下密封。
二甲苯(1)20分钟
二甲苯(2) 20分钟
100%乙醇20min
95%乙醇10分钟
80%乙醇10分钟
将柜子通风晾干，用止水笔在纸巾周围画一圈。
将切片在PBS中浸泡5分钟*2。
0.4%Tritonx室温10分钟
将切片在PBS中浸泡5分钟*3。
3% H2O 2 rt 10分钟
将切片在PBS中浸泡5分钟*3。
0.25%胰蛋白酶RT10min
将切片在PBS中浸泡5分钟*3。
封闭缓冲液(含3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100的PBS溶液)室温60分钟
倒入封闭缓冲液，不要洗。
在封闭缓冲液中过夜抗4℃
取出切片，重新加热1h，在PBS中浸泡5 min*3。
两个防粘连缓冲液gar 1: 200 (gam 1: 100)，RT 1h
将切片在PBS中浸泡5分钟*3。
DAB显色5-10分钟(50 μ l A+50 μ l B+900 μ l PBS+5 μ l 3%H2O2)
如果是增强型DAB，只需要1min。
将切片浸入PBS中以停止显色，并用HE染色1s。
将滑架放入泡沫盒中，用流水冲洗15min，肉眼看到淡淡的紫色时停止。
如果颜色太深，用0.1-0.5%盐酸乙醇分色1-2秒(或更长)。
将85%乙醇脱水5分钟。
5%乙醇5分钟
无水乙醇5分钟
无水乙醇5min
二甲苯(1)10分钟
二甲苯(2)10分钟
用中性树胶密封，并在室温下干燥。
4.石蜡切片免疫荧光法:
组织切片在室温下密封。
二甲苯(1)20分钟
二甲苯(2) 20分钟
100%乙醇20min
95%乙醇10分钟
80%乙醇10分钟
将柜子通风晾干，用止水笔在纸巾周围画一圈。
将切片在PBS中浸泡5分钟*2。
0.4%Tritonx室温10分钟
将切片在PBS中浸泡5分钟*3。
将切片在PBS中浸泡5分钟*3。
0.25%胰蛋白酶RT10min
将切片在PBS中浸泡5分钟*3。
封闭缓冲液(含3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100的PBS溶液)室温60分钟
倒入封闭缓冲液，不要洗。
在封闭缓冲液中过夜抗4℃
取出切片，重新加热1h，在PBS中浸泡5 min*3。
封闭缓冲液中的第二种荧光抗体gar-cy3 1: 1000，gam-488 1: 1000 rt 1h
DAPI (1: 1000，请根据二抗的说明稀释二抗)
将切片在PBS中浸泡5分钟*3。
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